為保證實驗數(shù)據(jù)精彩呈現(xiàn)首先選定ELISA類型,ELISA技術可用于測定抗原,也可用于測定抗體。ELISA試劑盒方法中有三個必要的試劑:
(1) 固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent)
(2) 酶標記的抗原或抗體,稱為"結合物"(conjugate)
(3) 酶反應的底物
ELISA試劑盒分為以下幾種類型,實驗君首先需要根據(jù)自己的待檢物來確定試劑盒類型:
1) 雙抗體夾心法:針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相捕獲抗體和酶標檢測抗體。適用于測定二價或二價以上的大分子抗原如血漿中的細胞因子,不適用于測定半抗原及小分子單價抗原。同理,也有雙抗原夾心法測抗體。
2) 直接法:將抗原直接固定在固相載體上,加入酶標記的一抗,即可測定抗原總量。此法操作手續(xù)簡短,因無須使用二抗可避免交互反應。
3) 間接法:間接法是檢測抗體常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)來檢測與固相抗原結合的待檢抗體。
4) 競爭法:小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以采用競爭法模式。當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體。
根據(jù)樣品中檢測物水平來選擇ELISA試劑盒:
如果實驗君對于樣品中待檢物的水平?jīng)]有任何可參考的數(shù)據(jù),選擇寬動力學檢測范圍的試劑盒。如果樣品中待檢物的含量很低,建議選擇高靈敏度的試劑盒。為了降低基質(zhì)效應,有必要用稀釋液至少做2倍稀釋。如果樣品中待檢物含量遠超過試劑盒的檢測范圍(標曲范圍), 也需做適當?shù)谋稊?shù)稀釋。在zui后計算結果時,需乘以相應的稀釋倍數(shù)。
根據(jù)樣本可獲得性來選擇ELISA試劑盒:
通常而言,商業(yè)化試劑盒的樣品用量都在50ul或100ul, 但也有一些供應商的試劑盒對樣品的用量要求可少至10ul。如果您的樣品很珍貴或較難獲取,則需要認真考慮試劑盒對樣品用量的要求。如果樣品量少,且要做多因子檢測時更需謹慎。
ELISA試劑盒細致比較試劑盒關鍵性技術參數(shù):
ELISA試劑盒的關鍵技術參數(shù)包括板內(nèi)差異性、板間差異性、批間差異性、重復性、特異性及交叉反應性、回收率等。如果實驗君經(jīng)常開展ELISA實驗,建議使用同一廠家的試劑盒,這樣可盡量保證數(shù)據(jù)的重復性(當然前提是實驗條件的一致性)。對于科研用的定量ELISA試劑盒,不同的生產(chǎn)廠家使用的抗體對、酶以及底物、生產(chǎn)工藝和研發(fā)實力不盡相同,自然不同廠家試劑盒測出的數(shù)據(jù)會有差異。
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