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免疫標記技術是將一些既易ELISA試劑盒測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的ELISA試劑盒免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發(fā)光物質、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，Mr在40000左右，等電點7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，ELISA試劑盒而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內穩(wěn)定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。ELISA試劑盒酶標記物質量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質量的酶(如辣根過氧化物酶，ELISA試劑盒簡稱HRP)國內已有商品供應。高質量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、ELISA試劑盒不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質且操作簡便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：

(1)來源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質穩(wěn)定;

(3)ELISA試劑盒酶活性和量能

用簡單方法測定。ELISA試劑盒目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，ELISA試劑盒它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。ELISA試劑盒HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，ELISA試劑盒純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。